蛋白质与核酸的紫外线交联

蛋白质与核酸的紫外交联 UV Crosslinking of Proteins to Nucleic Acids

用紫外交联仪照射蛋白质-核酸复合物会导致核酸与紧密接触的蛋白质之间形成共价键。因此，紫外交联可用于根据DNA结合蛋白与DNA识别位点的特定相互作用选择性地标记DNA结合蛋白。由于标记转移，可以快速可靠地测定粗混合物中DNA结合蛋白的分子量。

该过程可分为三个阶段：(1) 将含有目标蛋白质的提取物与放射性、均匀标记的DNA片段一起孵育，该片段含有对蛋白质的高亲和力结合位点；(2) 蛋白质-DNA复合物用紫外线照射交联并用核酸酶消化，只留下交联并与DNA结合蛋白紧密接触的标记DNA片段；(3) 通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影确定交联蛋白质的分子量。该技术的一个优点是，可以很容易区分特异性结合到DNA探针上的蛋白质和非特异性结合的蛋白质。

基本方案是，使用溴脱氧尿苷取代的探针进行紫外交联。与未取代的DNA相比，含有胸苷卤化类似物（如溴脱氧尿苷 (BrdU)）的DNA分子对紫外交联更为敏感。虽然使用BrdU取代的探针对于通过紫外线检测蛋白质-DNA交联并非必不可少，但在许多情况下它是有帮助的。

用紫外线将蛋白质与核酸交联是一种快速准确地确定粗提取物中DNA结合蛋白分子量的简单方法。此外，可以通过测量过量未标记竞争DNA竞争蛋白质结合位点的能力来严格确定光加合物的特异性。

紫外交联方法的目的是将放射性标记从DNA结合位点特异性地转移到结合蛋白上。用紫外线照射DNA会产生嘌呤和嘧啶自由基。如果蛋白质分子靠近自由基，则可以形成共价键，将蛋白质交联到DNA上。在溶液中，嘧啶对光化学改变的敏感度大约是嘌呤的10倍。已知有几种氨基酸可以与嘧啶碱基形成光加合物，包括半胱氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。将胸腺嘧啶的卤化类似物（如溴脱氧尿苷 (BrdU)）掺入DNA的细胞对紫外线诱导的蛋白质交联的敏感度比正常细胞高出几倍。这是因为用溴原子取代胸腺嘧啶甲基会产生一种在紫外线下更容易形成自由基的分子。由于溴基团的范德华半径与甲基基团大致相同，因此几种细胞酶会交替使用胸腺嘧啶和BrdU。因此，生成BrdU取代的DNA探针非常简单。使用BrdU的另一个重要原因是，用于交联这些探针的紫外线波长较长，对蛋白质的损害比较短波长的紫外线要小。此外，将BrdU取代到结合位点有时会增加所研究的蛋白质-DNA相互作用的亲和力。

下图：紫外交联仪XEPU-1208，可精准控制紫外线剂量，紫外线辐照均匀可控，是进行蛋白质与核酸紫外交联的理想工具！

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Reference: University of Pennsylvania School of Medicine UV-Crosslinking of Proteins to Nucleic Acids