绿色荧光蛋白GFP及其变体的特点和应用

荧光蛋白的起源和发展

20世纪60年代初，绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）的发现预示着细胞生物学的新纪元，使研究人员能够应用分子克隆方法，将荧光团部分与多种蛋白质和酶靶标融合，以监测生命系统中的细胞过程。当荧光激发光源的最新技术进步相结合时，绿色荧光蛋白GFP及其衍生物已广泛应用在众多植物、动物和活细胞成像实验中。

1961年，华盛顿大学实验室的Osamu Shimomura和Frank Johnson从维多利亚多管发光水母中分离出一种钙依赖性生物发光蛋白，并将其命名为水母发光蛋白。在分离过程中，观察到第二种蛋白质缺乏水母发光蛋白的蓝色发光生物发光特性，但在紫外线照射下能够产生绿色荧光。由于这一特性，该蛋白最终被命名为绿色荧光蛋白（GFP）。在接下来的二十年里，研究人员确定水母发光蛋白和绿色荧光蛋白GFP在水母的发光器官中共同作用，将钙诱导的发光信号转化为该物种的绿色荧光特征。

绿色荧光蛋白GFP及其变体的发展和应用

尽管绿色荧光蛋白GFP基因于1992年被克隆，但直到几年后，当融合产物被用于追踪细菌和线虫中的基因表达时，才意识到作为分子探针的巨大潜力。自这些早期研究以来，绿色荧光蛋白GFP已被设计用于产生大量不同颜色的突变体、融合蛋白和生物传感器，这些都被广泛称为荧光蛋白 (fluorescent protein)。最近，来自其他物种的荧光蛋白已被识别和分离，从而进一步扩展了调色板。随着荧光蛋白技术的快速发展，这种基因编码的荧光团除了简单追踪活细胞中标记的生物分子之外，还具有广泛的应用前景，现已得到充分认识。

如今，科学家们已经开发出多种荧光蛋白遗传变体，其荧光发射光谱曲线几乎涵盖整个可见光谱。对原始维多利亚水母绿色荧光蛋白的诱变努力产生了新的荧光探针，其颜色范围从蓝色到黄色，是生物研究中最广泛使用的体内报告分子之一。绿色荧光蛋白GFP及其突变等位基因形式、蓝色、青色和黄色荧光蛋白用于构建荧光嵌合蛋白，在用工程化载体转染后，可以在活细胞、组织和整个生物体中表达。红色荧光蛋白 (red fluorescent protein, RFP) 已从其他物种（包括珊瑚礁生物）中分离出来，并且同样有用。荧光蛋白技术避免了纯化、标记和将标记蛋白引入细胞的问题或产生针对表面或内部抗原的特异性抗体的任务。

绿色荧光蛋白GFP

野生型绿色荧光蛋白GFP：虽然野生型绿色荧光蛋白GFP产生显着的绿色荧光并且极其稳定，但激发峰值接近紫外范围。由于紫外线需要特殊的光学考虑，并且可能会损坏活细胞，因此它通常不太适合使用光学显微镜进行活细胞成像。

增强型绿色荧光蛋白EGFP：通过引入将 65 位丝氨酸改变为苏氨酸残基 (S65T) 的单点突变，绿色荧光蛋白的激发峰值转移到488nm（在青色光区域）。这种突变存在于更流行的绿色荧光蛋白变体中，称为增强型GFP (EGFP)。

ZsGreen1：一种名为ZsGreen1的珊瑚礁蛋白，其发射峰值在505nm，已被引入作为增强型绿色荧光蛋白EGFP的替代品。在哺乳动物细胞中表达时，ZsGreen1相对于EGFP非常明亮，但在产生融合突变体方面的效用有限，并且与其他珊瑚礁蛋白类似，有形成四聚体的倾向。

红色荧光蛋白RFP

DsRed：个被广泛利用的珊瑚源荧光蛋白源自Discosoma striata，通常称为DsRed。DsRed的荧光发射光谱在583nm处有一个峰值，而激发光谱在558nm处有一个主峰。红色荧光蛋白对动物成像的能力更强。

mCherry：mCherry 是一种亮红色单体荧光蛋白，由DsRed多轮定向进化产生。mCherry 是一种成熟速度非常快的单体，具有低酸敏感性，因此可以在转染或转录激活后很快看到结果。

黄色荧光蛋白YFP

增强型黄色荧光蛋白EYFP：黄色荧光蛋白YFP及其变体增强型黄色荧光蛋白EYFP的开发，使其成为最亮、使用最广泛的荧光蛋白之一。增强型黄色荧光蛋白EYFP的亮度和荧光发射光谱相结合，使该探针成为成像实验的候选者。当与增强型青色荧光蛋白 (ECFP) 或GFP2配对时，增强型黄色荧光蛋白EYFP也可用于能量转移实验。然而，黄色荧光蛋白YFP存在一些问题，因为它对酸性 pH 值非常敏感，在 pH 6.5 时会损失大约50%的荧光。此外，EYFP还被证明比绿色荧光蛋白GFP更容易对氯离子和光漂白剂敏感。

珊瑚礁蛋白ZsYellow1：ZsYellow1最初是从原产于印度洋和太平洋的Zoanthus物种克隆而来，可产生真正的黄色发射，是多色应用的理想选择。与绿色荧光蛋白ZsGreen1 一样，该衍生物在创建融合方面不如增强型黄色荧光蛋白EYFP那么有用，并且有形成四聚体的倾向。

蓝色荧光蛋白BFP，青色荧光蛋白CFP

绿色荧光蛋白GFP的蓝色和青色变体是通过直接修饰天然荧光团中第66位的酪氨酸残基而产生的。蓝色荧光蛋白BFP和青色荧光蛋白CFP荧光蛋白的增强版本（EBFP和ECFP）的亮度也仅为增强型绿色荧光蛋白EGFP的25%~40%左右。此外，蓝色和青色荧光蛋白的激发在不常用的光谱区域中，因此需要专门的滤光片组和激发光源，建议使用荧光手电筒GFPfinder-2101VI。

如何激发荧光蛋白？

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