一文详解凝胶电泳

什么是凝胶电泳？

凝胶电泳（Gel electrophoresis）是一种根据生物大分子（DNA、RNA、蛋白质等）及其片段的大小和电荷对其进行分离和分析的方法。它在临床化学中用于通过电荷或大小（IEF琼脂糖，基本上与大小无关）分离蛋白质，在生物化学和分子生物学中用于通过长度分离DNA和RNA片段的混合群体，估计DNA和RNA碎片的大小或通过电荷分离蛋白质。

通过施加电场使带负电的分子穿过琼脂糖或其他物质的基质来分离核酸分子。短分子比长分子移动得更快，迁移得更远，因为短分子更容易通过凝胶的孔迁移。这种现象称为筛分（sieving）。蛋白质通过琼脂糖中的电荷分离，因为凝胶的孔太大而无法筛选蛋白质。凝胶电泳也可以用于纳米颗粒的分离。

凝胶电泳在电泳过程中使用凝胶作为抗对流介质或筛分介质，电泳是带电粒子在电流中的运动。凝胶可以抑制电场施加引起的热对流，也可以作为筛选介质，减缓分子的通过；凝胶也可以简单地用于保持最终的分离，从而可以应用电泳后染色。DNA凝胶电泳通常用于分析目的，通常在通过聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA之后进行，但也可以在使用其他方法（如质谱法、RFLP、PCR、克隆、DNA测序或Southern印迹）进行进一步表征之前用作制备技术。

凝胶电泳是一种能够根据电荷、大小或形状对分子进行分类的过程。利用电场，分子（如DNA）可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺制成的凝胶移动。电场由一端的负电荷和另一端的正电荷组成，前者推动分子穿过凝胶，后者拉动分子穿过凝胶。被分选的分子被分配到凝胶材料中的井中。将凝胶放置在电泳室中，然后将电泳室连接到电源上。当施加电场时，较大的分子在凝胶中移动得更慢，而较小的分子移动得更快。不同大小的分子在凝胶上形成不同的带。

下图：凝胶电泳示意图

凝胶类型

术语“凝胶”是指用于容纳并分离目标分子的基质。在大多数情况下，凝胶是交联聚合物，其组成和孔隙率是基于待分析目标的比重和组成来选择的。当分离蛋白质或小核酸（DNA、RNA或寡核苷酸）时，凝胶通常由不同浓度的丙烯酰胺和交联剂组成，产生不同大小的聚丙烯酰胺网状物。当分离较大的核酸（大于几百个碱基）时，优选的基质是纯化的琼脂糖。在这两种情况下，凝胶都会形成一种固体但多孔的基质。与聚丙烯酰胺不同，丙烯酰胺是一种神经毒素，必须采取适当的安全预防措施来处理，以避免中毒。琼脂糖由不带电荷的碳水化合物的长链组成，没有交联，形成具有大孔的凝胶，可以分离大分子和大分子复合物。

凝胶电泳实验中，最常用的凝胶类型是琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。每种类型的凝胶都非常适合不同类型和大小的分析物。聚丙烯酰胺凝胶通常用于蛋白质，并且对DNA的小片段（5-500bp）具有非常高的分辨力。另一方面，琼脂糖凝胶对DNA的分辨力较低，但分离范围较大，因此用于大小通常为50–20000bp的DNA片段，但脉冲场凝胶电泳（PFGE）可以实现超过6Mb的分辨率。聚丙烯酰胺凝胶以垂直配置运行，而琼脂糖凝胶通常以潜艇模式水平运行。它们在浇铸方法上也有所不同，因为琼脂糖是热定型的，而聚丙烯酰胺是在化学聚合反应中形成的。

凝胶电泳的应用

凝胶电泳用于法医学、分子生物学、遗传学、微生物学和生物化学。使用紫外透射仪XEPU-1126，可以快速进行照胶和切胶操作。用计算机操作的相机记录图像，并测量感兴趣的带或点的强度，并将其与加载在同一凝胶上的标准或标记进行比较。根据所进行的分析类型，其他技术通常与凝胶电泳的结果结合使用，提供了广泛的领域应用。一些例子如下：

● 限制性内切酶消化后DNA分子大小的估计，例如在克隆DNA的限制性作图中。

● PCR产物的分析，例如分子遗传诊断或基因指纹。

● 在Southern转移之前的限制性基因组DNA的分离，或在Northern转移之前的RNA的分离。

凝胶电泳之DNA可视化

凝胶电泳完成后，可以对凝胶中的分子进行染色，使其可见。可以使用溴化乙锭对DNA进行染色观察，溴化乙铵插入DNA时在紫外光下发出荧光。使用紫外透射仪XEPU-1126进行DNA可视化的具体步骤如下：

（1）打开紫外透射仪XEPU-1126上方的透明盖板（盖板的作用是隔绝紫外线），将凝胶放置在紫外透射仪的滤色片上。

（2）打开紫外透射仪的开关，选择合适的紫外线波长，建议用302nm中波紫外线进行照胶。

（3）旋转旋钮，调整紫外线强度，以达到理想的荧光效果。通常强度越高，荧光激发效果越好。

（4）通过透明盖板观察DNA条带，进行照胶和切胶等操作。

下图：紫外透射仪XEPU-1126

蛋白质可以使用银染（silver stain）或考马斯亮蓝染料（Coomassie brilliant blue）进行染色和可视化。由于EB有毒性，越来越多的凝胶电泳实验开始使用新型无毒荧光染料，例如SYBR Green和SYBR Safe，这类新型染料需要用蓝光激发，需要用到蓝光切胶仪XEPU-1126B。

使用蓝光切胶仪观察SYBR Green染色后的DNA

使用蓝光切胶仪观察SYBR Safe染色后的DNA

下图：蓝光切胶仪XEPU-1126B

后续实验操作

可以使用额外的分离方法，例如等电聚焦（isoelectric focusing）或SDS-PAGE。然后对凝胶进行物理切割，并分别从每一部分提取蛋白质复合物。然后可以分析每种提取物，例如通过凝胶内消化后的肽质量指纹或从头肽测序。这可以提供大量关于复合体中蛋白质身份的信息。

关键词

凝胶电泳 Gel electrophoresis

紫外透射仪 UV transilluminator

蓝光透射仪 Blue light transilluminator

荧光染料 Fluorescent dye

荧光激发 Fluorescence excitation