如何选择适合生物研究的荧光蛋白

荧光蛋白可以与转基因细胞或动物中的蛋白质融合，与抗体缀合，甚至用作酶反应的底物。自19921年克隆最初的绿色荧光蛋白 (GFP) 基因以来，可用的荧光蛋白种类呈爆炸式增长。那么，在进行生物研究时，选择哪种荧光蛋白？哪种荧光蛋白亮度高？可以考虑以下几个因素：激发光和发射光波长、亮度、成熟时间、光稳定性、ph值、温度、氧气水平、密码子优化和聚合性质。

激发光和发射光波长 Excitation and emission

如果您计划使用多种荧光蛋白，建议选择具有不同发射峰的荧光蛋白。如果发射峰重叠，就很难区分不同荧光蛋白的荧光表达。在选择荧光蛋白激发光源时，根据您所使用的荧光蛋白的激发光和发射光波长，选择合适的激发光。

荧光蛋白的亮度 Brightness

通常选择可用光谱内最亮的荧光蛋白，以获得更清晰的荧光信号。荧光越亮，越容易识别阳性样本。荧光蛋白的亮度由多种因素决定，包括荧光蛋白固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系数、量子产量和光稳定性决定）、荧光蛋白激发光源的光学特性（激发光的波长和强度，滤光片的光谱）和照相机或人眼对发射光谱的敏感性。

荧光蛋白成熟时间 Maturation

成熟时间是指荧光蛋白正确折叠、形成发色团并开始发出荧光所需的时间。对于活细胞中的时间敏感事件，短的成熟时间可能很重要。例如，Superfolder GFP (sfGFP) 可以在 10 分钟内完成折叠，而 mOrange2 则需要四个多小时。

光稳定性 Photostability

光漂白(bleaching)是光稳定性的衡量标准，指激发后发色团失去发光能力的时间。针对不同的生物研究实验，我们需要选择不同光稳定性的荧光蛋白。对于需要不多于10张图片的短期生物成像实验，光稳定性通常不是一个主要考虑因素，如果需要进行长时间的延时实验，建议选择具有高光稳定性的荧光蛋白。T-sapphire的漂白半衰期为 25 秒，EGFP 更稳定，漂白半衰期为 174 秒。

pH值，温度和氧气

与大多数蛋白质一样，荧光蛋白也会受到 pH 值、温度和氧气水平的影响。根据您的实验环境，选择合适的荧光蛋白。pH 值会影响激发峰和发射峰，并且大多数荧光蛋白对酸敏感。 一些荧光蛋白可以根据 pH 值的变化而改变荧光强度（例如 pHTomato）。pKa值是pH敏感性的良好指标，代表一半发色团发出荧光时的 pH 值。温度和氧气水平都会影响荧光蛋白的成熟时间：缺氧条件往往会延迟荧光蛋白的成熟时间，温度超出荧光蛋白更佳范围也是如此（例如 EGFP 已优化为在 37度下工作）。 然而，像 UnaG（一种从日本淡水鳗鱼（Anguilla japonica）中分离出来的 GFP）等新型荧光蛋白，即使在氧气水平较低时也会发出荧光。

密码子优化 Codon optimization

由于大多数荧光蛋白源自水母或珊瑚蛋白，而不是您可能使用它们的哺乳动物细胞和组织之类的东西，因此所使用的氨基酸密码子可能存在种间差异。这可能导致荧光蛋白表达不良，从而导致荧光信号低。许多新版本的荧光蛋白已经过密码子优化，以反映哺乳动物细胞的偏好。以GFP为例，Jürgen Haas 等人通过修改GFP密码子序列将信号提高了 40-120 倍。如果您使用较旧的质粒来生成融合蛋白，它可能不包含修改过的荧光蛋白序列。在选择荧光蛋白时，确保您的荧光蛋白序列已被修改以用于特定物种。

聚合性质 Oligomerization

确定您的荧光蛋白是单体还是二聚体（单体通常用蛋白质名称前缀“m”表示，例如 mCherry）。许多早期的荧光蛋白容易形成寡聚体，寡聚化会影响融合蛋白的生物学功能。 例如，EGFP 是一种单体，在足够高的浓度下使用时可以形成二聚体，这可能会扭曲亚细胞细胞器 7 或破坏 FRET8 等实验。在绝大多数情况下，建议使用真正的单体荧光蛋白。

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